本文章于2018年由“浙江师范大学化学与生命科学学院”发表在中国生物工程杂志上，文章对穿膜肽（CPP）在肿瘤等疾病的诊断及治疗中的应用进行综述，进一步说明CPP在临床中的应用地位。

摘要

近年来，细胞穿膜肽（CPP）在生物医药领域应用广泛，其通过高效的胞内递送能力，为肿瘤治疗及疾病诊断提供了创新策略。CPP 在肿瘤靶向治疗中可精准携带药物至病灶，增强疗效；在医学影像诊断中，能有效递送成像剂，提升检测灵敏度。针对 CPP 在药物传递系统中的特性，研究者致力于改进其潜在不足（如靶向特异性、稳定性等），并探索其与其他治疗手段联合应用的可能性，以拓展治疗潜力。本文旨在综述 CPP 的作用机制、在肿瘤等疾病诊疗中的应用进展，以及优化改进策略，为推动其临床转化提供参考。

关键词 穿膜肽 肿瘤 CPP

细胞穿透肽（cell-penentrating peptides,CPP），又称靶向多肽、蛋白质转导结构域或特洛伊木马肽，是一类由不超过 30 个氨基酸残基组成的短肽序列。其核心特性是能够穿透生物膜，并将多种化合物（包括小分子、核酸、蛋白质、病毒、成像剂及药物等）递送至细胞内部，为生物分子的胞内递送提供了关键工具，在生物医药领域具有重要应用价值。

1988 年，两个研究团队分别发现了首个能跨越细胞膜的蛋白质——人类免疫缺陷病毒-1（HIV-1）的反式激活蛋白（Tat）。研究表明，Tat 蛋白的 α 螺旋结构域富含碱性氨基酸，是其穿透细胞膜并易位至细胞核、激活病毒基因表达的关键区域。其中，Tat 十二肽（GRKKRRQRRRPQ）被证实为最小功能单元，许多细胞穿透肽（CPP）由此衍生。1991 年，果蝇触角基因编码的同源结构域被发现可穿过神经元膜并移位至细胞核，诱导神经元形态分化。其第三螺旋的 16 个氨基酸组成的穿孔素肽（RQIKIWFQNRRMKWKK）能以不依赖能量的方式高效穿透细胞膜，进一步拓展了 CPP 的研究领域。

在过去 30 年中，细胞穿透肽（CPP）被广泛应用于基础研究及感染、炎症、神经退行性疾病和癌症等疾病的临床前期研究。然而，由于其存在细胞膜渗透性不足、递送效率低及靶向肿瘤细胞特异性差等缺陷，仅有部分 CPP 进入临床试验评估。目前，研究聚焦于开发能特异性靶向癌细胞并递送抗癌药物的活性分子。基于多肽的递送系统具有显著优势：多肽是非免疫原性分子，通常无细胞毒性，在生理条件下稳定性高，且能高效快速地将蛋白质、核酸等多种运载物递送至细胞内，相较于其他递送系统展现出独特的应用潜力。

1、CPP的分类

目前已发现超过 100 种细胞穿透肽（CPP），其氨基酸序列差异显著。这些 CPP 可通过多种方式分类，包括起源、功能、序列特征、摄入机制及生物医学应用等。根据物理化学性质的不同，CPP 主要分为三大类：阳离子 CPP、疏水性 CPP 和两性 CPP。这种分类方式为理解 CPP 的结构与功能关系提供了重要框架。

1.1 阳离子CPP

常用的阳离子细胞穿透肽（CPP）富含正电荷，由精氨酸（Arg）和赖氨酸（Lys）等带正电的氨基酸短链构成，在介导各种治疗性药物进入细胞的过程中发挥关键作用。其中，应用最广泛的两种阳离子 CPP 包括 TAT 介导的多肽（如 Antennapedia 同源域衍生肽）和含有 9 个精氨酸的寡聚精氨酸多肽 Polyariginines。这些阳离子 CPP 通过其正电荷特性有效促进药物的细胞内化，是药物递送研究中的重要工具。1.2 疏水性CPP

第二类细胞穿透肽（CPP）为疏水性肽，其序列富含非极性氨基酸残基。这些疏水性残基通过维持低电荷状态并借助疏水相互作用促进细胞对多肽的摄取。典型的疏水 CPP 包括来自卡波成纤维细胞生长因子（K-FGF）和成纤维细胞生长因子-12（FGF-2）的信号序列，它们通过独特的疏水性结构实现高效的细胞穿透功能。

1.3 两性CPP

第三类为双亲肽，其序列同时包含极性和非极性氨基酸区域，典型代表包括多抗原肽（MAP）、整合素受体靶向肽 Arg-Gly-Asp（RGD）及单纯疱疹病毒蛋白 VP22。这类肽具有细胞间转运能力，并主要聚集于细胞核。研究还发现，部分双亲肽可通过非共价相互作用（如静电和疏水作用）与生物分子形成稳定复合物，从而改善其递送效率。例如，HIV-1 gp41 蛋白的疏水融合结构域与SV40大T抗原（KKKRKV）的核定位信号连接形成两性CPP MPG（GALFLGFLGAAGSTMGAWSQPKKKRKV）和 Pep-1，它们能够与寡核苷酸或蛋白质 / 肽结合，帮助运载物实现细胞内定位，展现了双亲肽在药物递送中的独特优势。

2、CPP的摄入机制

尽管细胞穿透肽（CPP）的细胞摄取机制尚未完全阐明，但根据其物理化学性质，推测可能存在多种独立或协同作用的机制。CPP 的摄取效率受运载物类型、大小及电荷等因素影响，导致不同的累积效果。目前普遍认可的主要摄取机制包括内吞作用介导的途径、反胶束模型和类地毯机制。这些机制的多样性反映了 CPP 在跨膜递送过程中与细胞膜及运载物的复杂相互作用。

2.1内吞介导

内吞作用是大多数细胞穿透肽（CPP）的主要细胞摄取途径，其过程分为两个关键步骤：内吞入胞和内体逃逸。内吞入胞涉及多种机制，包括网格蛋白介导的胞吞作用、不依赖网格蛋白的内吞作用（如通过脂筏或细胞膜腔内膜的内吞）以及微胞饮等方式。这些不同的内吞途径共同促进 CPP 进入细胞，体现了其摄取机制的多样性。

2.2 反胶束模型

反胶束模型是解释细胞穿透肽（CPP）穿膜机制的理论之一。该模型指出，富含赖氨酸和精氨酸的 CPP 可在低温下非能量依赖地穿过细胞膜，且不依赖膜受体。其过程如下：带正电荷的精氨酸和赖氨酸残基首先与细胞膜上带负电荷的磷脂结合，促使膜融合形成含有CPP 的口袋状胶束；随后，胶束携带 CPP 穿过细胞膜向细胞质侧移动；当胶束完成跨膜后发生反转，最终释放 CPP 及其运载物进入细胞内。这一模型揭示了 CPP 通过电荷相互作用与膜磷脂结合，进而实现跨膜递送的独特机制。

2.3 类地毯机制

类地毯机制最初用于解释蛙皮抗菌肽穿透微生物细胞膜并导致细胞溶解的现象，也可解释高浓度细胞穿透肽（CPP）对细胞的毒性作用。根据该模型，带正电荷的 CPP 结构域首先与细胞膜表面带负电荷的磷脂结合，像地毯一样覆盖膜表面。当肽在膜局部区域达到一定浓度时，会破坏膜的稳定性，形成孔洞，从而使 CPP 及其运载物得以进入细胞内。这一机制揭示了 CPP 通过电荷相互作用破坏膜结构、实现跨膜递送的特殊方式，同时解释了高浓度下的细胞毒性效应。

3、CPP在肿瘤治疗及疾病诊断中的应用

癌症作为人类主要死因之一，化疗是其常见治疗手段，但存在药物难以渗透肿瘤组织、高剂量导致耐药性及毒副作用等局限。药物难以进入肿瘤的原因包括肿瘤致密结缔组织基质（如胰腺癌）和高间质压力（由异常血液及淋巴循环引发）。细胞穿透肽（CPP）可通过促进药物渗透进入肿瘤细胞并增强外渗，实现高效递送且不损伤正常组织。借助治疗性抗体或肽对肿瘤靶分子的特异性识别，CPP 能将抑癌药物富集于肿瘤部位，从而显著提升药物对癌细胞的杀伤活性，同时降低对健康组织的毒性。此外，内源性刺激（如特定酶激活）和外部刺激（如轻度热疗）可进一步增强细胞特异性及药物积累，优化 CPP 的递送效果。

3.1 CPP与生物活性分子的递送

蛋白质、核酸等生物分子具有调节细胞功能的治疗潜力，但其较大的分子量或富含阴离子的特性，使其在体内因细胞膜的选择性渗透而活性显著低于体外实验。细胞穿透肽（CPP）能够突破这一屏障，通过促进这些分子跨越细胞膜，使其直达病灶发挥作用，从而有效提升生物分子在体内的治疗效果。

3.1.1小分子递送

细胞穿透肽（CPP）的核心功能在于能够将多种化合物递送至细胞质并维持其生物学活性。例如，紫杉醇、环孢菌素 A 和甲氨蝶呤等化疗小分子与 CPP 结合后，仍能保留原有活性。尽管 CPP-药物偶联物在体外纯化体系中可能表现出活性下降（如CPP-甲氨蝶呤偶联物效力较单独药物降低20倍），但其高效的细胞摄取能力可弥补这一缺陷。研究证实，CPP偶联物能显著提高生物活性分子进入细胞的水平，甚至在抗甲氨蝶呤的肿瘤细胞系中仍表现出强效细胞毒性。这一特性凸显了CPP通过增强药物递送效率，有效克服药物活性损失的独特优势。

3.1.2 肽和蛋白质递送

细胞对生物活性大分子的富集存在限制，而细胞穿透肽（CPP）可作为分子转运蛋白，将这些大分子递送至细胞内并达到有效浓度以发挥生物学效应。研究以 STAT-6 肽抑制剂为例，揭示了 CPP 调节转录因子活性的机制：将 STAT-6 抑制肽与 HIV-Tat 衍生的 PTD4 CPP 缀合后，缀合物可高效内化进入细胞，通过抑制 STAT-6 磷酸化及二聚化来阻断其活性。实验表明，该缀合物在小鼠上呼吸道递送后，显著减弱了卵清蛋白诱导的炎症反应和黏液产生，为过敏性鼻炎和哮喘等疾病提供了潜在治疗策略。

CPP 在调节免疫应答方面的应用体现在脓毒症治疗中。脓毒症因淋巴细胞和树突细胞凋亡导致免疫抑制，而抑制细胞凋亡可提高生存率。研究将抗凋亡蛋白 Bcl-xL 及其 BH4 结构域与 Tat CPP 缀合，发现该缀合物能有效递送抗凋亡分子进入细胞，显著降低脓毒症小鼠体内淋巴细胞的凋亡率。这是首次利用 CPP 传递抗凋亡蛋白对抗脓毒症诱导的细胞凋亡，证明了该系统在减少免疫系统消耗、提高脓毒症患者生存率方面的有效性，为脓毒症治疗提供了新的思路。

3.1.3 核酸和siRNA递送

核酸等阴离子生物分子的递送极具挑战性，因其在无辅助条件下摄取效率极低，而载体辅助递送又常引发内体滞留或被核酸酶降解。目前主要通过两种策略解决这一难题：一是通过工程手段促进内体逃逸，二是利用中性核酸类似物如肽核酸（PNA）。PNA 以肽骨架替代传统核酸的糖磷酸主链，形成电中性分子，既能抵抗细胞内核酸酶的降解，又保留了天然核酸的碱基互补配对能力，为核酸递送提供了更稳定且高效的解决方案。

细胞穿透肽（CPP）在核酸递送领域展现出新的应用潜力，尤其是新型 CPP “眼部递送肽”（POD）可有效将小干扰 RNA（siRNA）和质粒 DNA 递送至眼组织。研究表明，POD 能将 siRNA 导入人胚胎视网膜细胞，实现超过 50% 的基因沉默效应，并成功递送质粒 DNA，使转基因表达效率超过 50%。此外，局部施用 POD - 染料缀合物于小鼠角膜后，分子可快速分布至邻近眼组织并显著提高细胞摄取速度，证实了 POD 增强核酸向眼组织递送的可行性。尽管这一发现为眼部疾病治疗提供了新策略，但 POD - 核酸缀合物在眼组织中的具体分布机制及摄取效率仍需进一步研究验证。

3.2 CPP在影响学中的应用

当前，细胞穿透肽（CPP）在传递成像剂和生物传感器领域成为研究热点。活体内部特征和生理结构的可视化对疾病的理解、诊断及治疗至关重要，例如在手术中直接观察病变组织，或在生物医学研究中追踪干细胞分化及免疫细胞动态。尽管非侵入性成像技术（如荧光成像和磁共振成像）已用于体内组织可视化，但显像剂常面临穿透能力不足、细胞摄取效率低、靶向性差及荧光团光稳定性弱等问题。CPP 作为运载工具与成像标记结合，可有效增强显像剂的细胞穿透和组织递送能力，从而优化体内荧光成像效果，为疾病精准诊断和生物过程研究提供新策略。

目前，稳定性更高、摄取效率更强的荧光团-CPP缀合物已成为新型显像剂。例如，Tat 肽修饰的荧光素掺杂二氧化硅颗粒（约70nm）可高效穿透血脑屏障，实现大鼠神经元组织标记；Jiang等设计的荧光素肽发夹结构，通过可切割接头调控阳离子 CPP 的细胞摄取，利用癌细胞过表达的蛋白酶选择性标记肿瘤。这些研究表明，CPP 通过增强显像剂的组织穿透和靶向能力，显著优化了体内荧光成像效果。

半导体纳米晶体（量子点，QD）凭借其量子限制效应展现出优异的光学特性（如强发光性、耐光漂白、窄发射光谱等），成为分子荧光团的有力替代。然而，QD 在生物环境中稳定性不足且细胞摄取效率低，制约了其在体内成像的应用。尽管 QD 具有诸多优势，但其生物相容性和跨膜递送能力仍需改进。

CPP 技术为解决 QD 的递送难题提供了有效方案。研究表明，Tat 修饰的 CdS:Mn/ZnS 量子点可快速穿透血脑屏障并标记脑组织，且通过手持灯即可实现可视化，展现了其在病变组织显像中的潜力。此外，Pep-1、聚精氨酸等 CPP 也可用于 QD 的细胞递送。CPP 与 QD 的连接方式多样，包括共价键结合（如半胱氨酸 / 赖氨酸残基）、生物素 - 链霉亲和素介导的非共价结合，或通过多组氨酸肽接头与纳米晶体金属的亲和力结合。这些策略显著提高了 QD 的生物相容性和细胞摄取水平，推动了 QD 在生物医学成像中的应用。

4、CPP的改造与完善

细胞穿透肽（CPP）是一种有效的细胞内药物递送工具，但其最大局限在于缺乏显著的细胞类型特异性。由于 CPP 的摄取机制依赖于与细胞膜脂质的强结合，大多数 CPP 会被多种细胞非选择性内化。这种广泛的细胞内化特性，使得 CPP 在临床应用中难以将高活性药物精准递送至癌细胞，成为其选择性治疗的主要障碍。

增强细胞穿透肽（CPP）靶向特异性的核心策略是将其与归巢肽或靶向配体缀合。通过结合 CPP 的跨膜能力与归巢肽的细胞类型识别能力，可显著提升药物递送的特异性。例如，抗 Her-2/neu 肽模拟物与 Tat 衍生 CPP 融合后，能特异性识别过表达 ErbB2 的乳腺癌细胞，降低非特异性摄取；RGD 肽、叶酸或透明质酸等肿瘤相关配体与 CPP 偶联，也可实现对肿瘤上皮细胞的靶向。尽管这些策略已展现潜力，但开发更高效的体内递送方法仍需进一步研究。

CPP 家族在质膜结合方式及易位机制上存在显著差异，这种差异使其对特定细胞类型具有选择性。例如，穿膜肽可优先结合神经元表面的 α2,8 - 聚唾液酸并被选择性摄取；抗癌肽 Bufforin IIb 的穿透基序通过与癌细胞表面神经节苷脂的特异性相互作用，实现靶向定位及内化。这些特性揭示了 CPP 在药物递送中的独特潜力，同时强调了深入研究其与细胞膜成分相互作用机制的必要性，以进一步优化 CPP 对化疗药物的靶向递送效率。

改造细胞穿透肽（CPP）缀合物的关键策略之一是引入可切割接头，如酸不稳定的腙键、还原敏感的二硫键或蛋白酶可降解的肽键，以调控药物在肿瘤部位的释放。然而，这种修饰需确保 CPP 或运载物的结构变化不会显著影响其生物活性。对于肽类运载物，可通过基因工程技术将编码序列插入 CPP 的 N 端或 C 端，构建复合肽（如 TAT-BID），增强癌细胞对凋亡诱导配体的敏感性。若运载物为基因（如核酸），则可利用 CPP 的阳离子特性与带负电荷的核酸（如 siRNA、质粒）通过静电作用形成复合物。例如，R9 CPP 与靶向 Plk4 的 siRNA 混合后，在体外和体内均能有效递送并抑制 MDA-MB-231 乳腺癌细胞中 Plk4 的表达，进而减缓肿瘤生长。这些改造方法为优化 CPP 的药物递送效率和靶向性提供了重要思路。

5、展望

近年来，基因组学和蛋白质组学技术的发展推动了药物对疾病分子靶点的精准识别，但药物的细胞渗透性仍是其有效发挥作用的关键瓶颈。许多药物在体外表现出理想活性，却因难以穿透细胞膜而在体内实验中效果显著降低。细胞穿透肽（CPP）作为一种高效递送载体，通过增强细胞摄取能力显著提升了多种治疗剂的功效，其优势包括低毒性、作用可控性强，且能实现从小分子药物到蛋白质、核酸等生物大分子的跨膜转运，展现出广阔的应用前景。未来研究需针对不同疾病类型和生理环境，系统评估 CPP - 治疗剂复合物的效果，进一步拓展其在临床治疗中的应用，为疾病治疗提供创新策略。

【相关文献】

张裕丰,谢梦佳,周舒蕾,徐玲玲,赵铁军.细胞穿膜肽在肿瘤靶向治疗及疾病诊断中的应用[J].中国生物工程杂志,2019,(第6期).

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